Comprendre et acquérir la démarche expérimentale à partir de l'expérience historique de Calvin et collaborateurs

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  L'expérience historique de Calvin et collaborateurs

  Cette expérience a une dimension historique car :

  • elle a valu a ses auteurs le prix Nobel de 1961 ;
  • elle a permis de connaître une bonne partie du cycle de Calvin en peu de temps, ce qui est dû à l'ingéniosité de son protocole ;
  • elle a permis d'aller ensuite plus loin dans la connaissance du fonctionnement énergétique des cellules chlorophylliennes.

  En bref, à partir de chlorelles, des algues unicellulaires photosynthétiques, Calvin et ses collaborateurs ont pu déterminer quelles étaient les molécules produites par la fixation du CO₂ atmosphérique lors de la photosynthèse. Ils sont aussi pu déterminer l'ordre d'apparition de ces molécules.
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  Les connaissances de l'époque

  • Les organismes chlorophylliens sont capables de fixer le CO₂ atmosphérique pour produire des sucres, tels que le glucose ;
  • ce phénomène qui dégage de l'O₂ est appelé la photosynthèse (littéralement « synthèse de sucres suite à l’effet de la lumière ») et elle nécessite de l'énergie lumineuse ;
  • la question était alors de savoir comment les organismes chlorophylliens étaient capables de produire des sucres à 6 carbones à partir du CO₂ (molécule à un carbone).
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  Les hypothèses

  La fixation du CO₂ atmosphérique en glucose :

  • doit passer par plusieurs étapes via la production de molécules organiques intermédiaires ;
  • en particulier, la première phase doit être l'addition d'une molécule de CO₂ sur un molécule à 2 C pour en faire une à 3 C, le phopshoglycérate (PGA) ;
  • la fixation ne se fait donc pas « d'un coup » en assemblant 6 molécules de CO₂ pour en faire une de glucose.
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  Le protocole

  Le choix a été fait d'utiliser des chlorelles car ce sont des unicellulaires photosynthétiques qu’il est donc facile de cultiver et d’étudier.
  
   

  Étapes du protocole	Objectif
  Étape 1 : mettre les chlorelles en présence de CO2, de lumière et d'O2 (les chlorelles respirent).	Permettre aux cellules d'effectuer la photosynthèse.
  Étape 2 : faire passer un petit nombre de chlorelles dans un tube coudé où on peut injecter du CO2 radioactif (donc traçable).	Suivre les molécules produites lors de la phase chimique.
  Étape 3 : récupérer cette petite fraction de chlorelles marquées radioactivement dans de l'éthanol bouillant ce qui les tue instantanément tout en extrayant les molécules qu'elles contiennent.	Stopper les réactions de la phase photochimique.
  Étape 4 : séparer les molécules extraites les unes des autres par chromatographie et révéler celles qui contiennent du carbone radioactif par autoradiographie.	Identifier les molécules ayant incorporé du carbone radioactif.
  Étape 5 : recommencer avec une autre fraction de chlorelles et une injection de CO2 marqué dans le tube coudé à un endroit différent.	Modifier le temps de mise en présence du CO2 marqué et donc la durée de la phase chimique.

  
    La question est de savoir pourquoi avoir utilisé un tube coudé :

  • on pouvait injecter du CO₂ marqué à différents endroits ;
  • les chlorelles étaient donc en présence de CO₂ marqué plus ou moins longtemps ;
  • on pouvait donc suivre l'apparition dans le temps des différentes molécules dans lesquelles se fixait le carbone radioactif.

  
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  Les résultats et leur interprétation

  Comparons les chromatographies à différentes durées d'exposition au CO₂ avec une chromatographie de molécules connues (en bas).
  
   

  Observation	Interprétation
  Apparition d'une tache au même niveau que le PGA du témoin au bout de 2 secondes.	La molécule de PGA (3 C) est donc la première à incorporer le carbone radioactif.
  Apparition de deux taches radioactives aux mêmes niveaux que le C3P et C5P2 du témoin au bout de 5 secondes.	Le C3P (3 C) et le C5P2 (5 C) sont des molécules apparaissant après le PGA. Elles en seraient donc issues.
  Apparition d'une multitude de taches radioactives aux mêmes niveaux que le saccharose (sucre) et les acides aminés du témoin au bout de 30 secondes.	Toutes ces molécules composées de nombreux carbones sont issues du C3P et du C5P2 (et donc du PGA)

  
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  Les conclusions

  1. La fixation du CO₂ se fait donc sur une molécule à 2 C pour en donner une à 3 C, le PGA ;
  2. le PGA est transformé en une autre molécule à 3 C, le C₃P, et une molécule à 5 C, le C₅P₂ ;
  3. le carbone radioactif se retrouvera ensuite incorporé dans diverses molécules : sucres (saccharose), acides aminés, etc. On remarquera que le glucose n'est ici pas visible.
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  Les limites de l'expérience

  Le protocole de cette expérience possède bien sûr des limites et n'a pas permis de révéler tous les mécanismes de la fixation du CO2. En particulier :

  • pourquoi ne retrouve-t-on pas de glucose ou de sucres à 6 C sur le chromatogramme ?
  • quelle est la molécule qui se forme directement après le PGA ? Le C3P ou le C5P2 ?
  • on ne peutpas dire que toutes les molécules impliquées dans la synthèse de sucres ont été découvertes, des espèces intermédiaires en très faible quantité ne sont peut être tout simplement pas visibles. Serait-ce le cas du glucose par exemple ?